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恒遠告訴大家:關(guān)于WB實驗的常見問題以及解決方案(3)
更新時間:2012-09-14 點擊次數(shù):2275

 

上海恒遠生物科技有限公司是一家生物技術(shù)企業(yè),主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑的研發(fā)、銷售。并代理銷售OmegaSigma、R&DATCC、HYCLONE等二十多家國外,致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù),滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實驗需求。
21、想分離的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適?積層膠的濃度又該用多少?這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎?
答:200kd的蛋白不好做,分離膠用7%,積層膠 3.5%。
22
、如果上樣量超載,要用什么方法來增加上樣量? 
答:可以濃縮樣品,也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載30%是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了,而且小分子量的也要,可以考慮加大膠的厚度,可以試試1.5mm的。
23
、蛋白變性后可以存放多久?
答:-80,一兩年沒有問題。zui關(guān)鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉也是被酶水解了。
24
、我所測定的蛋白分子量是105KD,按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%,但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方,不知為何?
答:上述提到的兩種凝膠均可以使用,因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi),但需注意條帶位置。
25
、二抗是生物素化的抗體,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案后,封閉液是否要作調(diào)整,能否再用5%的脫脂奶粉呢?好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的,是嗎? 
解答:不能使用脫脂奶粉,因為脫脂奶粉中含生物素,用BSA代替應(yīng)該好一點.
26
、問一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達量有關(guān)系嗎?
答:Western Blot一般上樣30100微克不等,結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關(guān)系,也與顯色時間長短有關(guān)。開始摸條件時,為了拿到陽性結(jié)果,各個步驟都可以量多一點時間長一點,當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復(fù)地試了,當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。
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、做組織樣品的western的時候,怎樣處理樣品?
答:必須進行研磨、勻漿、超聲處理,蛋白質(zhì)溶解度會更好,離心要充分,膜蛋白需用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提超速離心。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF)。
28
、問大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?
答:做200kd蛋白的Western Blot時要注意,分離膠選擇>7%的;剝膠時要小心;轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長;要做分子量參照(否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析)。
29
、有什么方法可以提高上樣量?
答:a)可以濃縮樣品;增大上樣體積來增大上樣量;b)5倍的上樣緩沖液來稀釋變性
30
、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求?
答:上樣量要根據(jù)實驗的要求來定,如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等,如果只是要定性,則沒有太大的關(guān)系,盡量多上就行了,但是不要超載。

如果你想了解更多關(guān)于western blot的信息,來函!

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