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恒遠(yuǎn)告訴大家:WB實(shí)驗(yàn)的常見問題答疑(1)
更新時間:2012-07-25 點(diǎn)擊次數(shù):2288

 

恒遠(yuǎn)告訴大家:關(guān)于WB實(shí)驗(yàn)的常見問題以及解決方案(1
上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司是一家生物技術(shù)企業(yè),主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑的研發(fā)、銷售。并代理銷售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家國外,致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù),滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實(shí)驗(yàn)需求。
1western blot 的優(yōu)點(diǎn)
答:靈敏,可達(dá)ng級,用Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級。方便,特異性高。
2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白?
答:原因有很多: a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì),換一種細(xì)胞;b) 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了,你必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c) 你的抗體不能識別目標(biāo)蛋白,多看看說明,看是否有問題。
3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,為什么呢?
答: a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性*,可以適當(dāng)提高SDS 濃度,同時將樣品煮沸時間延長, b) 也不排除你的抗原濃度過高,這時再加入適量上樣緩沖液即可。
4、我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?/span>10KD),請問怎么做WB?
答:可以選擇0.2μml的膜,同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起,再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。
5、我的目的帶很弱,怎么加強(qiáng)?
答:可以加大抗原上樣量。這是zui主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。
6、膠片背景很臟,有什么解決方法?
答:減少抗原上樣量,降低一抗?jié)舛?,改變一抗孵育時間,提高牛奶濃度。
7、目標(biāo)帶是空白,周圍有背景,是為什么?
答:你的一抗?jié)舛容^高,二抗上HRP 催化活力太強(qiáng),同時你的顯色底物處于一個臨界點(diǎn),反應(yīng)時間不長,將周圍底物催化完,形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?,或更換新底物。
8、我的膠片是一片空白,是怎么回事?
答:如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng),將底物消耗光;b) ECM底物中H2O2,不穩(wěn)定,失活;c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置;d) 二抗失活。
9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答:a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了,可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.b) 顯影時間過長。
10、DAB好還是ECM好?
答:DAB 有毒,但是比較靈敏,是HRP zui敏感的底物;ECM結(jié)果容易控制,但被催化時靈敏度差一點(diǎn),但如果達(dá)到閥值,就特別靈敏,可以檢測pg 級抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況
如果你想了解更多關(guān)于western blot的信息,來函!

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