這年頭,做科研的不會做ELISA實驗,都不好意思出門。做ELISA實驗容易,想要做好ELISA實驗還是有點難度的!求助,做ELISA實驗老是失敗怎么辦?今天恒遠生物小編為大家總結ELISA實驗經(jīng)驗,讓大家避免掉入“坑"里,以后的ELISA實驗必定是一路綠燈!
酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,簡寫ELISA或ELASA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。
一、ELISA可用于測定抗原,也可用于測定抗體。ELISA實驗中有三種必要的試劑:
① 固相的抗原或抗體(用于結合到固相載體上)
② 標記的抗原或抗體(標記物)
③ 作用的底物(顯色劑,用于顯色)
二、ELISA實驗成功七要素:
①成功采集到樣品
②樣品保存妥當
③成功復溫樣品,確保沒有降解
④試劑盒質量沒問題
⑤成功做出標準曲線
⑥操作過程沒有出現(xiàn)差錯,編號沒有混亂
⑦顯色之后顏色明顯,且在檢測范圍之內(nèi)
三、四種常見ELISA方法
1.直接ELISA
將抗原固定于ELISA板上,然后用酶標抗體直檢測抗原。
相較于其它類型的ELISA實驗,直接ELISA實驗步驟少,檢測速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反應,測定結果不容易出錯。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的,樣本中的靶蛋白及其他雜質蛋白都會與ELISA板結合,實驗背景會比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準備能夠與其特異性結合的一抗,實驗不太靈活。另外由于沒有使用二抗,信號沒有被放大,降低了測定的靈敏度。
2.間接ELISA
先將抗原結合到ELISA板上,隨后分兩步進行檢測:首先加入檢測抗體與抗原特異性結合,隨后加入酶標二抗檢測并利用底物顯色。
與直接ELISA相比,間接ELISA用到酶標二抗,具有更高的靈敏度,也需要更少的標記抗體,更經(jīng)濟。間接ELISA還提供了更大的靈活性,因為不同的一抗能夠與單一標記的二抗一同使用。間接ELISA實驗的缺點是存在交叉反應的可能性(酶標二抗直接與抗原結合),可能會增加背景,同時與直接ELISA相比,間接ELISA實驗多了二抗孵育的步驟,實驗周期延長。
3.夾心ELISA
先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中,然后加入樣品,接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標抗體,則可稱為直接夾心ELISA;如果檢測抗體不帶有標記,則還需要使用酶標二抗與檢測抗體結合,這種稱為間接夾心ELISA。
夾心ELISA的靈敏度高,它比直接或間接ELISA敏感2-5倍;同時夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結合,擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進行檢測,靈活性較高。夾心ELISA的缺點是對配對抗體要求很高,如果沒有標準化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對抗體,則需要進行配對抗體定制并進行優(yōu)化,因為降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應是非常重要的。
4.競爭ELISA法
預先將抗原包被在固相載體上,并加入酶標記的特異性抗體。實驗時,加入待檢抗原(或抗體),如果待檢物是抗原,則待檢抗原與預先包被在固相載體上的抗原競爭結合酶標抗體;如果待檢測物是抗體,則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標抗體競爭結合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結合的酶標抗體,最后加底物顯色。需要注意的是顯色結果與待檢抗原(或抗體)的量成反比。
競爭ELISA相對以上介紹的三種方法更復雜一些,但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式。其主要優(yōu)點在于可檢測不純的樣品,且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高,但存在整體敏感性和專一性較差的問題。
四、ELISA常見問題與解決方法
1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結果
① 樣品、試劑被污染,或加樣時操作不當導致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑,小心操作。
② 酶標板洗滌不che底——洗板前先將抗體溶液倒干凈,然后清洗液倒?jié)M板孔,確保能充分洗滌。
③ 抗體量過多導致非特異性結合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體,稀釋抗體到適當濃度。
2.酶標板整體背景高
① 抗體非特異性結合——應確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當?shù)姆忾]液以防止非特異性結合。
② 底物結合濃度過高——對底物進行適當稀釋。
③ 反應時間過長——當酶標板顯色足夠進行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應,適當縮短顯色時間。
④ 底物溶液污染——正常底物溶液應是澄清透明的,若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染,應更換新的底物溶液。
⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應在避光條件下進行。
3. 復孔之間重復性差
① 樣品數(shù)量不整齊,加樣時間有長有短——加重復孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。
② 加樣量不一致——樣品稀釋前應充分混勻,并且使用同一移液槍。
③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復測定樣品時,操作條件、人員應盡可能與上次保持一致。
4. 吸光值偏高或偏低
① 樣品中待測抗原含量太低會導致測定結果偏低——可嘗試增加樣品使用量。
② 加入抗體量不合適會造成結果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結果更好盡可能調整抗體的zui適用量。
③ 孵育時間太短導致檢測結果偏低——適當延長抗體或抗原的孵育時間,確保待測樣品與檢測抗體能充分結合。
④ 孵育溫度不適合——應保證抗體在最適宜條件下進行孵育(一般37℃孵育1h)。
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