適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。今天的技術(shù)文章中就為大家講解一下細胞的凍存與復(fù)蘇操作方法！
操作步驟
（一）細胞凍存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；
2. 取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中；
3. 離心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的終密度為5×106/ml～1×107/ml；
5. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；
7. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
（二） 細胞復(fù)蘇
1.將冷凍管從液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，細胞融化后要盡快(約1min)移出37℃水浴。37℃水浴時間延長會提高細胞死亡率，復(fù)蘇過程中一般細胞死亡率在20%～25%之間。
2.迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒，然后放置在冰浴上。
3.小心開啟瓶蓋，把細胞轉(zhuǎn)入含有4mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后把培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱，26℃～28℃培養(yǎng)1h，讓細胞貼壁。
4.細胞貼壁后，小心移棄培養(yǎng)基，主要是去掉DMSO(懸浮生長細胞要通過離心沉淀除去DMSO)、死細胞及其碎片，加5mL新鮮培養(yǎng)基，26℃～28℃培養(yǎng)。
5.細胞培養(yǎng)24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單層，便可以傳代。
6.詳細記錄復(fù)蘇細胞的名稱、數(shù)量、復(fù)蘇時間、存放部位等。
注意事項
1．從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，為 對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液；
2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷；
3．凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。
